Uso di ultrasuoni focalizzati per il rilascio e l'identificazione di biomarcatori putativi: studio su cellule tumorali pancreatiche

Il tumore pancreatico (PC) ad oggi è una delle principali cause di morte per cancro. L’alta incidenza e mortalità si devono alla diagnosi tardiva attribuibile all’assenza di sintomi, presenti solo nelle fasi più avanzate della malattia, e all’indisponibilità di test diagnostici specifici e sensibili. È di grande importanza perciò identificare nuovi biomarcatori non invasivi, per una diagnosi più precoce. Negli ultimi anni, i microRNA, per le loro caratteristiche, sono stati considerati come candidati biomarcatori nel cancro, in quanto possono essere rilasciati dal microambiente tumorale nel torrente circolatorio, dove risultano stabili nei confronti delle RNasi endogene, attraverso meccanismi attivi e passivi. Alcuni studi hanno dimostrato la possibilità di applicare metodi basati sugli ultrasuoni (US) per promuovere il rilascio di molecole da modelli in vitro/in vivo, potenziando quindi quello che è il meccanismo fisiologico di secrezione. A questo scopo, è stata utilizzata un’innovativa tecnologia basata sull’uso di ultrasuoni generati da un prototipo strumentale (SonoWell®), al fine di amplificare il rilascio di molecole (ad esempio acidi nucleici o proteine/peptidi) da modelli cellulari di PC per identificare nuovi potenziali biomarcatori. Tre linee cellulari di PC, T3M-4, Panc-2 e Paca-44, sono state coltivate in piastre multiwell e sottoposte a trattamento con ultrasuoni. In seguito a estrazione dai surnatanti di coltura dell’RNA totale, inclusa la frazione a basso peso, è stato effettuato un profiling dei microRNA. Sono stati identificati 11 microRNA, rilasciati nei surnatanti e con valore statisticamente significativo, su cui si è prioritariamente concentrata l’analisi. Inoltre, 30 miRNA rilevati nel terreno di coltura, seppur statisticamente non significativi, sono risultati in comune a tutte le linee cellulari tumorali analizzate, e sono stati pertanto considerati anche essi potenziali biomarcatori. A completamento dell’analisi, per approfondire il ruolo biologico dei microRNA identificati, sono state effettuate indagini bioinformatiche in silico per evidenziare i geni target e le pathway in cui essi risultavano coinvolti. Tramite l’utilizzo di dataset da campioni da pazienti affetti da carcinoma pancreatico disponibili on-line, è stata effettuata una prima validazione dei microRNA più interessanti, che ha mostrato coerenza con i risultati ottenuti. Oltre ai microRNA, sono state analizzate anche le proteine rilasciate in seguito a stimolo ultrasonico. L’esame ha messo in luce circa 30 fattori proteici di interesse, considerabili come biomarcatori candidati. Le stesse analisi, estese ad una linea cellulare normale epiteliale pancreatica (HPanEpic), hanno mostrato profili di microRNA e proteine caratteristici per essa, suggerendo così una specificità delle molecole rilasciate e identificate nei modelli tumorali per il cancro del pancreas. In conclusione, questo lavoro, basato sull’uso di una tecnologia innovativa di sonoporazione, ha permesso l’identificazione di nuove molecole (microRNA e proteine) su cui orientare nuovi studi, al fine di comprenderne il ruolo biologico e le possibili applicazioni in ambito clinico, in particolare relativamente alla loro utilizzazione come biomarcatori non invasivi di malattia.